巨噬細(xì)胞無論是在維持機(jī)體的生理穩(wěn)態(tài)還是斡旋組織的病理炎性，都發(fā)揮重要的作用。此外，巨噬細(xì)胞也促進(jìn)多種疾病的病理生理學(xué)，如包括癌癥和各種炎癥性紊亂。巨噬細(xì)胞功能的多樣性也正如它起源的復(fù)雜性（當(dāng)然爭(zhēng)議性更大），形態(tài)的異質(zhì)性，表型的可塑性。因此，巨噬細(xì)胞作為一種具有可塑性，多能性和異質(zhì)性的細(xì)胞群體,在體內(nèi)和體外不同的微環(huán)境影響下,表現(xiàn)出獨(dú)特的表型和功能，體現(xiàn)的是一個(gè)在時(shí)間和空間上受一系列機(jī)體免疫學(xué)網(wǎng)絡(luò)所調(diào)控的復(fù)雜動(dòng)態(tài)連續(xù)性生物學(xué)過程。
為了更好的研究巨噬細(xì)胞功能，設(shè)計(jì)研究實(shí)驗(yàn)時(shí)，要在時(shí)間上（疾病的發(fā)生和發(fā)展）和空間上（病灶的原位，組織，器官）考慮到巨噬細(xì)胞的起源，更新，補(bǔ)充，形態(tài)，表型和功能的連續(xù)性，動(dòng)態(tài)性和網(wǎng)絡(luò)性。
Q1.為什么Clodronate Liposomes（氯膦酸二鈉脂質(zhì)體）是研究巨噬細(xì)胞功能的利器？
A1：巨噬細(xì)胞在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。它們主要通過可溶性分子，如細(xì)胞因子和趨化因子的介導(dǎo)來調(diào)節(jié)許多非吞噬細(xì)胞的功能。巨噬細(xì)胞還通過攝取和消化微生物或非自身顆粒和大分子參與身體的“穩(wěn)態(tài)”。內(nèi)吞物的消化是由其溶酶體酶介導(dǎo)的。
脂質(zhì)體是人工制備的脂質(zhì)囊泡，由夾帶水性隔室的同心磷脂雙層組成。它們可用于包封溶解在水溶液中的強(qiáng)親水性分子，例如氯膦酸鹽，一種為人類應(yīng)用開發(fā)的無毒二膦酸鹽。
注射后，氯膦酸鹽脂質(zhì)體起到特洛伊木馬的作用。巨噬細(xì)胞攝取氯膦酸鹽脂質(zhì)體并消化脂質(zhì)體膜。氯膦酸鹽不會(huì)被消化，并會(huì)留在巨噬細(xì)胞內(nèi)。更多氯膦酸鹽將在巨噬細(xì)胞中積聚，因?yàn)樗鼤?huì)攝取和消化更多的氯膦酸鹽脂質(zhì)體。當(dāng)氯膦酸鹽在細(xì)胞內(nèi)聚集到一定的濃度后，氯膦酸鹽會(huì)通過啟動(dòng)其程序性細(xì)胞死亡即細(xì)胞凋亡來清除巨噬細(xì)胞[1]。
通過選擇氯膦酸鹽脂質(zhì)體的正確給藥途徑，給藥時(shí)間點(diǎn)，給藥頻率和給藥部位，可以清除特定器官或組織中的巨噬細(xì)胞。因此，氯膦酸鹽脂質(zhì)體是研究巨噬細(xì)胞功能的極好工具[2]。
Q2.Clodronate Liposomes（氯膦酸二鈉脂質(zhì)體）和Clodronate（氯膦酸二鈉）的半衰期是多少？
A2：死亡巨噬細(xì)胞釋放的氯膦酸鹽的半衰期（t1 / 2）為數(shù)分鐘[3]，因?yàn)橛坞x氯膦酸鹽通過腎臟系統(tǒng)迅速從循環(huán)中被清除。 由于難以通過細(xì)胞膜，游離氯膦酸鹽分子不易進(jìn)入細(xì)胞，包括脂質(zhì)體磷脂雙分子層。 然而，如果它們留在周圍的介質(zhì)中，它們可能會(huì)慢慢積聚到細(xì)胞中[4]。
氯膦酸鹽脂質(zhì)體的半衰期很難確定。 脂質(zhì)體難以從血液中分離，并且它們?cè)趧?dòng)物中的分布不均勻。 此外，氯膦酸鹽脂質(zhì)體的半衰期取決于巨噬細(xì)胞攝取和消化所需的時(shí)間，這由許多因素決定，例如：動(dòng)物疾病模型的免疫全能性，給藥途徑，給藥劑量。
Q3.實(shí)驗(yàn)清除巨噬細(xì)胞不成功，可能的原因有哪些？
A3：氯膦酸鹽脂質(zhì)體活性的失敗可能是由于各種原因：
1）有效期已過：超過有效期后無法確保活性;
2）在極端溫度下儲(chǔ)存：氯膦酸鹽脂質(zhì)體應(yīng)儲(chǔ)存在4到8攝氏度之間。冷凍脂質(zhì)體或溫度高于30攝氏度會(huì)影響膜的穩(wěn)定性并降低氯膦酸鹽脂質(zhì)體活性;
3）脂質(zhì)體懸浮液的稀釋：這會(huì)影響懸浮液中的滲透壓，這可能導(dǎo)致脂質(zhì)體膜的不穩(wěn)定;
4）給藥方案不合理：給藥方案應(yīng)仔細(xì)選擇并考慮多種因素，例如：
a.打算消耗的巨噬細(xì)胞的類型（例如庫普弗細(xì)胞，小膠質(zhì)細(xì)胞，肺泡巨噬細(xì)胞，破骨細(xì)胞）。例如，可以通過氣管內(nèi)給藥靶向肺泡巨噬細(xì)胞，而內(nèi)皮/上皮屏障另一側(cè)的間質(zhì)巨噬細(xì)胞不會(huì)被該給藥途徑靶向;
b.是否打算短期或長期消耗它們;
c.動(dòng)物的體重：較大的動(dòng)物需要更多的氯膦酸鹽脂質(zhì)體才能達(dá)到清除閾值。
5）脂質(zhì)體懸浮液在使用前未重新懸浮：脂質(zhì)體在儲(chǔ)存期間傾向于沉淀，確保在使用前輕輕搖動(dòng)重懸，以防止僅注射不含脂質(zhì)體的PBS溶液;
6）注射時(shí)出錯(cuò)：確保注射是否成功非常重要。例如，如果您在尾靜脈注射期間看到鼓包形成，則可能是您注射到皮膚組織了，沒有注射到靜脈里。當(dāng)腹膜內(nèi)注射時(shí)，確保將脂質(zhì)體懸浮液注射到腹腔內(nèi)（而不是在腸內(nèi)）。為了驗(yàn)證脂質(zhì)體是否已到達(dá)您想要的位置，可以使用熒光Dil脂質(zhì)體;
7）檢驗(yàn)清除的手段是否正確：需要選擇正確的標(biāo)記來確定清除是否成功。此外，您需要考慮到每種給藥方案和（動(dòng)物）模型的巨噬細(xì)胞的消耗和再增殖動(dòng)力學(xué)不同。
Q4.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在注射后立即死亡，可能的原因有哪些？
A4：這很可能是由于注射了非均質(zhì)的沉淀脂質(zhì)體。 沉淀的脂質(zhì)體可引起栓塞，從而部分或完全阻斷動(dòng)脈或靜脈中的血流。 由于脂質(zhì)體在儲(chǔ)存期間容易沉淀，因此請(qǐng)確保在使用前顛倒混勻。
另一個(gè)原因可能是脂質(zhì)體懸浮液的溫度。 脂質(zhì)體應(yīng)儲(chǔ)存在4到8攝氏度之間，但應(yīng)平衡到室溫后給藥。
注意：如果注射需要較長，脂質(zhì)體可能在注射器中沉淀，當(dāng)使用相同的注射器注射多只動(dòng)物時(shí)，這可能導(dǎo)致差異劑量。
Q5.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在注射后數(shù)小時(shí)或者數(shù)天死亡，可能的原因是什么？
A5：這很可能是由注射前或注射過程中的微生物污染引起的。當(dāng)注射氯膦酸鹽脂質(zhì)體時(shí)，巨噬細(xì)胞的清除可使動(dòng)物更容易受到感染，尤其是免疫缺陷動(dòng)物。
Q6.如何存儲(chǔ)脂質(zhì)體懸液？
A6：儲(chǔ)存在4-8oC（或39-47oF）之間。 脂質(zhì)體懸浮液不應(yīng)該冷凍，也不應(yīng)暴露在極端高溫下。
Q7.氯膦酸二鈉脂質(zhì)體懸液的濃度是多少？
A7：平均而言，整個(gè)脂質(zhì)體懸浮液的濃度為5mg氯膦酸鹽/ mL。 氯膦酸鹽以CH2Na2Cl2O6P2·5H2O的形式包封在脂質(zhì)體囊泡中。
Q8.脂質(zhì)體的粒徑和電荷是多少？
A8：所有的脂質(zhì)體（即氯膦酸鹽，PBS和熒光Dil脂質(zhì)體）都帶有輕微帶負(fù)電，因此不會(huì)聚集在一起。 懸浮液中的脂質(zhì)體沒有按特定的粒徑截留，脂質(zhì)體的大小不等（最大3微米）。 平均而言，脂質(zhì)體的大小為1.7微米。
Q9.溶解脂質(zhì)體的緩沖液是什么？
A9：所有的脂質(zhì)體制劑（即氯膦酸鹽脂質(zhì)體，對(duì)照脂質(zhì)體和熒光Dil脂質(zhì)體）懸浮于無菌磷酸鹽緩沖鹽溶液（PBS）：10mM Na2HPO4,10mM NaH2PO4，>140mM NaCl中。
Q10.如何檢測(cè)熒光Dil脂質(zhì)體？
A10：用熒光染料DiI標(biāo)記的脂質(zhì)體，作為對(duì)照，可用于研究脂質(zhì)體是否已通過所選的給藥方案達(dá)到靶向的巨噬細(xì)胞群。 熒光標(biāo)記將顯示脂質(zhì)體在組織內(nèi)的分布模式及其對(duì)巨噬細(xì)胞的攝取。 Dil標(biāo)記的脂質(zhì)體可以通過流式細(xì)胞術(shù)和熒光顯微鏡檢測(cè)。 DiI分子的激發(fā)和發(fā)射分別為549和565nm。
Q11.發(fā)表研究成果時(shí)，如何引用LIPOSOMA的產(chǎn)品？
A11：當(dāng)用LIPOSOMA的脂質(zhì)體制劑用于實(shí)驗(yàn)并打算發(fā)表研究成果時(shí)，引用格式：“LIPOSOMA，the Netherlands（clodronateliposomes.com）”。
參考文獻(xiàn)：
1. Van Rooijen, N., & Hendrikx, E. (2010). Liposomes for specific depletion of macrophages from organs and tissues. In Liposomes (pp. 189-203). Humana Press.
2. Van Rooijen, N., Sanders, A., & van den Berg, T. K. (1996). Apoptosis of macrophages induced by liposome-mediated intracellular delivery of clodronate and propamidine. Journal of immunological methods, 193(1), 93-99.
3. Fleisch, H. (2000). Bisphosphonates in bone disease: from the laboratory to the patient. Elsevier.
4.Claassen, I., Van Rooijen, N., & Claassen, E. (1990). A new method for removal of mononuclear phagocytes from heterogeneous cell populations in vitro, using the liposome-mediated macrophage ‘suicide’ technique. Journal of immunological methods, 134(2), 153-161.
